Western blotting檢測試劑盒（DAB）

試劑盒組成
1. 封閉試劑：30g(可配制400ml)脫脂奶粉及其他蛋白，緩沖鹽等混合物。
2. 10倍濃縮抗體稀釋液，50ml。
3. HRP標記二抗，0.5ml，效價1：400。
4. DAB顯色液（20×），5ml A+5ml B。

原理：

SDS-PAGE電泳后，蛋白質按照分子量大小分離，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）后，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶標記的第二抗體起反應，經過底物顯色以檢測電泳分離的特異性的蛋白。

操作步驟：

常規(guī)電泳轉膜后，
1) 清洗轉印膜：將膜剝離下后，作好標記，一般在左上角剪一缺口。室溫用TBS-T漂洗3次每次5min,以盡量洗去轉印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結合。
2) 按5g封閉試劑加100ml雙蒸水計，配制膜封閉液，配好的膜封閉液為乳白色懸液，將漂洗過的轉印膜，封閉液內，搖床震動，室溫封閉30min。 A@ 3) 用TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次每次5min。
3）將10×抗體稀釋液用雙蒸水稀釋成1×（10ml 10×抗體稀釋液加入90ml雙蒸水，混勻，可4℃保存三個月）。此稀釋液可作為一抗和二抗的稀釋液。
4）用1×的抗體稀釋液稀釋抗體。根據用量以及一抗的推薦稀釋濃度來稀釋一抗。將雜交膜放入雜交袋中，加入一抗工作液，封口，4℃孵育過ye或37℃搖動孵育2h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步將膜沿電泳方向剪成條，分別作好標記，分開孵育。
5）用TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次每次5min。
6）用稀釋好的抗體稀釋液稀釋抗體。根據用量，按10ml抗體稀釋液加入10ulHRP標記二抗的比例，配制二抗工作液。將雜交膜放入雜交袋中，加入加入二抗工作液，封口，4℃孵育過ye或37℃搖動孵育2h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。
7）用TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次每次10min。
8）配制DAB顯色：根據用量，取TBS-T  4ml，加入DAB顯色液A、DAB顯色液B各200ul，混勻，加在膜正面，室溫下顯色。在目標條帶顯出后，而且背景未出時，放入水中終止顯色。

注意事項：
1，   請根據一抗來源選擇試劑盒。括號里面代標一抗的來源而不是標本的來源。
2，   western blotting DAB顯色法操作簡單，但其敏感性與ECL發(fā)光發(fā)有一定的差距，一般只適用于豐度較高的蛋白。
3，   可以根據顯色結果來優(yōu)化實驗反應時間。如背景過深，可延長膜封閉時間，加長zui終漂洗次數與時間。如果條帶過弱，可延長抗體孵育時間。
4，   如果*沒有條帶，請檢查前期蛋白處理及實驗過程， 如果確認無誤，反復兩次依舊無結果，請換用ECL發(fā)光法顯色。
5，   TBS-T（0.01M）配制方法：稱取NaCl 8.5g ，Tris 1.21g ，用800ml的雙蒸水溶解，用鹽酸調PH到7.6，再加入0.5mlTween－20，用雙蒸水 加至1000ml，混勻即可。（也可按照自己的配制習慣來配制）