共聚焦實驗中培養(yǎng)耗材的選擇

激光共聚焦顯微鏡可以觀察到細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)標(biāo)記好的蛋白質(zhì)和分子，為生物學(xué)研究提供了更直觀的觀測方法。如今，激光共聚焦成像已經(jīng)是一個非常常規(guī)的實驗操作，應(yīng)用于生物學(xué)各個研究領(lǐng)域中。在細(xì)胞實驗中，如果要進(jìn)行一次激光共聚焦成像，除了要知道相關(guān)的顯微鏡參數(shù)設(shè)置和操作以外，樣品的準(zhǔn)備也是非常重要的一環(huán)。

爬片的使用

由于激光共聚焦實驗對觀測耗材的底部有著比較高的要求，普通的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)板或者培養(yǎng)瓶都不能直接用于激光共聚焦成像。

1.比較常用的是使用170μm左右厚度的蓋玻片作為激光共聚焦成像的細(xì)胞載體。但是使用蓋玻片，在實驗操作上是非常麻煩的，有時候需要將蓋玻片清洗并且烘干滅菌，才能開始使用。2.細(xì)胞爬片，雖然不需要清洗，但是還是需要進(jìn)行包被才能讓細(xì)胞正常貼壁生長。通常是將處理好爬片直接放在多孔板中，然后鋪細(xì)胞，熒光染色后，再用鑷子將爬片拿出，反過來放在滴有封片劑（甘油配置）的載玻片上，再進(jìn)行成像。如圖一所示：

圖一：使用蓋玻片和細(xì)胞爬片的做免疫熒光方法示意圖。

玻底培養(yǎng)皿/板的使用方法

這里要介紹的方法，大大簡化了樣品準(zhǔn)備流程，需要用到專為共聚焦實驗設(shè)計的共聚焦培養(yǎng)皿。共聚焦培養(yǎng)皿的底部為0.16-0.19mm的硼硅酸鹽玻璃，結(jié)合了標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)皿/板的便利性和蓋玻片的成像優(yōu)勢，可提供高倍放大顯微鏡及共聚焦圖像分析所需的最佳光學(xué)特性。

所有的操作都在培養(yǎng)皿中進(jìn)行，不再需要鑷子以及繁瑣的清洗，滅菌，包被程序（流程如圖二所示）

圖二：共聚焦專用培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備樣品流程，可以直接進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)－染色－成像操作

操作流程

1. 在超凈臺中打開共聚焦專用培養(yǎng)皿的滅菌包裝，拿出培養(yǎng)皿，加入細(xì)胞懸液，蓋上皿蓋，放入培養(yǎng)箱中靜置，等待細(xì)胞貼壁。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞長置合適密度再取出，進(jìn)行免疫熒光染色。

2. 吸出培養(yǎng)基，以PBS清洗細(xì)胞，再用2%的多聚甲醛PBS溶液固定細(xì)胞。

3. 20分鐘后，吸出固定液，加入0.1%Triton X-100

4. 10分鐘后，吸出Triton，清洗細(xì)胞后加入BSA封閉。

5. 加入抗體熒光染色后，吸出所有試劑，加入封片劑，可以開始共聚焦顯微成像。

使用共聚焦培養(yǎng)皿還有個好處：往往一個共聚焦掃描成像持續(xù)時間很長，培養(yǎng)皿中的液體非常容易揮發(fā)，共聚焦培養(yǎng)皿有皿蓋，可以減少揮發(fā)。